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酶結合物的制備

    免疫酶技術（immunoenzymatic technique）又稱酶免疫測定法（enzyme immunoassay,EIA）,是繼免疫熒光技術和放射免疫技術之后發(fā)展起來的又一種免疫標記技術。它是把抗原抗體的特異性反應和酶的催化作用相結合而建立的。該技術通過化學方法將酶與抗體或抗抗體結合，形成酶標記物，這些酶標記物仍保持免疫學活性和酶的活性，然后將它與相應的抗體或抗原起反應，形成酶標記復合物，結合在免疫復合物上的酶，在遇到相應的底物時，則催化底物產(chǎn)生水解、氧化或還原等反應，而生成可溶性或不溶性有色物質。然后根據(jù)顯色的深淺來反映待測樣品中抗原或抗體的含量，如生成的有色物質為可溶性，則可用肉眼比色或酶標測定儀測定光密度值（OD）定性或定量；如生成的有色物質為不溶性沉淀物，同時又是電子致密物質，則可用光學顯微鏡或電子顯微鏡識別和定位。因此，免疫酶技術是一項定位、定性和定量（敏感度可達每毫升ng~pg水平）的綜合技術。常用的酶是辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）。

    酶標抗體或抗抗體（抗免疫球蛋白）結合物可采用戊二醛法或過碘酸鹽氧化法制備。郭春祥建立的辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標記效果好，特別適用于實驗室的小批量制備。現(xiàn)將操作方法介紹如下： 

    （一） 結合物的標記將5mg HRP溶于05ml蒸餾水中，加入新配制的006mol/L NaIO4水溶液05ml，混勻，置冰箱30min，取出加入016mol/L乙醇水溶液05ml，室溫放置30min后，加入含5mg純化抗體的水溶液（或PBS）1ml，混勻并裝透析袋，以005mol/L、pH值95碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6h（或過夜）使之結合，然后吸出加NaBH4溶液（5mg/ml）02ml，置冰箱2h。將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨，冰箱放置30min，離心，將所得沉淀物溶于少許002mol/L、pH值74 PBS中，并對之透析過夜。次日再離心除去不溶物，即得酶抗體結合物。用002mol/L、pH值74 PBS加至5ml，進行測定后，冷凍干燥或低溫保存。 

    （二） 結合物中HRP與抗體量的測定酶標結合物于751型分光光度計上分別用280及403nm波長測定其光密度（OD），并計算出OD403與OD280之比值以及HRP與抗體的mol/L比。

結合物中HRP濃度（mg/ml）=OD403×04 

結合物中IgG濃度（mg/ml）=（OD280-OD403×03）×062 

酶/抗體mol/L比=HRP濃度IgG濃度×4 

    （三） 結合物稀釋度的測定

用酶結合物中抗體相應的抗原直接包被聚苯乙烯反應板，采用ELISA直接法測定酶結合物效價。通常本法制備的酶結合物作1∶10 000稀釋時，其OD403仍在01以上。